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相差显微镜的原理 使用相差显微镜的注意事项

发布时间:2022-10-12      点击次数:347

用普通光学显微镜观察时,难以辨清这样物体的结构,必须借助于相差显微镜,使用固定和染色等理化方法,使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化,即在颜色和亮度上有所差异,以供识别。
生物学研究经常要观察又薄又透明的样品,往往使用某种特定染料对细胞染色才可以观察到,而使用相差显微镜则不需要对样品进行处理就可以直接对细胞进行观察。相差显微镜能观察到透明样品的细节,适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。相差显微镜是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必*工具。
使用相差显微镜注意事项:
1、光源要强,相差显微镜聚光镜中的环状光阑遮掉大部分光源,所以应将视场光阑和孔径光阑*开启。
2、采用单色光,为了获得良好效果,相差显微镜应使用波长范围窄的近于单色的光源,相位的变化常因照明光线的波长而不同。通常采用绿色滤光片来调整光源波长,*好按厂家专用相衬镜检的绿色滤光片进行镜检。
3、切片要薄,以5~10μm左右为宜,或者更薄,如果样品过厚,样品的上层是很清楚的,深层则会模糊不清并且会产生相位移干扰及光的散射干扰,影响相差显微镜成象质量。
4、载玻长、盖玻片的厚度应符合标准,且不应有疵痕,制片的封固剂应均匀一致。如果有划痕,厚薄不均或凹凸不平,则会产生亮环歪斜及相位干扰。玻片过厚或过薄会使环状光阑亮环变大或变小。相差显微镜观察时要盖上盖玻片,否则环状光阑的亮环和相板的暗环很难重合。
5、物镜与聚光镜匹配:注意相差物镜和聚光镜里的相差环要调成对应的。简单的方法就是物镜上的Ph标示与聚光镜上的标示相同,换物镜时一定要记得把聚光镜转到对应的位置。
6、相位倒转,相差显微镜得到象的明暗反差正好相反。当相位差δ=0时是无法识别的,随着δ的增大反差变大,当δ继续增大到某一值后会出现相位倒转。用90%高吸光值(高反差)物镜时,这个转变值约为0.55λ,用70%标准吸光值的物镜时约为0.33λ。较高吸光值的物镜应该用于分辨较小的光程差。
7、晕轮和渐暗效应
晕轮:由于相位的延迟而变暗时,并不是光的损失,而是光在象平面上重新分配的结果,因此在黑暗区域明显消失的光会在较暗物体的周围出现一个明亮的晕轮,当环状光阑很窄时晕轮现象更为严重。
渐暗效应:相差观察相位延迟相同的较大区域时,该区域边缘会出现反差下降。
使用相差显微镜效果图:

相差显微镜的原理 使用相差显微镜的注意事项

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